类器官：神农尝百草式的肿瘤药物筛选模型

类器官（Organoid）是3D的细胞培养物，在结构以及功能上高度模拟人体器官，能够形成器官类似的空间结构并且分化出对应功能，具备细胞增殖分化、自我更新、自组装、可长期培养、遗传稳定性等特点。2009年是类器官领域的元年，类器官鼻祖Hans Clevers发表了重磅研究成果，成功从LGR5+的小肠干细胞中培养出了小肠类器官。随着类器官研究的不断深入，肿瘤类器官类别已经可以广泛覆盖各个实体瘤癌种，类器官技术也在2017年被Nature Method评为年度生命科学领域的年度技术。本篇将介绍**走入临床和最具有产业化潜力的类器官应用，即作为“患者替身”进行试药的类器官肿瘤药筛模型。类器官具有高度的临床相关性，可以在短时间内高效开展患者的药敏检测，使个性化的肿瘤用药指导成为可能。

图1:不同细胞来源的类器官及应用

来源：Sigma-Aldirch

介绍类器官药筛之前需要回答的关键问题是，为什么不继续使用现有的2D细胞模型或者PDX药筛模型？

永生化的细胞系可以检测靶点的结合情况以及细胞的活性，但是二维细胞模型体外成功扩增有一定的局限性，在传代之后会丧失原肿瘤的遗传异质性，容易发生优势克隆选择，且临床相关性较低。人源性动物移植模型（PDX）是将肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内的肿瘤模型，主要的问题有移植的成功率较低、构建成本高、周期长，对于药物筛选的通量有很大的局限性。另外，由于免疫缺陷小鼠体内肿瘤微环境和人体有一定差距，移植的肿瘤组织还可能发生小鼠样进化。肿瘤临床上可以推广的药筛模型必须能够满足三大基本要求包括需要在短时间内出具药敏检测结果、药物筛查通量高、预测效果准确，而类器官在这三方面对比其他药筛方法都显现出了强劲优势[1]。

速度快：类器官构建成功率高以及培养速度快。常规来说，在类器官培养一周之后就可以进行药筛。从样本采集到出具药敏结果的全流程已经可以很好地控制在2周之内。

通量高：从可筛查的药物通量来说，利用类器官不仅可以在孔板上进行多种药物的筛查，每个药物还可以测试不同的浓度，多个实验平行开展。

临床相关性强：类器官用于癌症药筛的临床相关性和预测有效性在多篇研究中都已经得到了较为充分的证实。Vlachogiannis G团队在Science发表了肿瘤类器官体外药敏测试指导临床用药的里程碑式研究，在71位转移性胃肠道癌提取了110份组织构建了类器官，共测试了55种抗癌药物。研究结果显示，类器官药筛达到了93%的特异性，100%的灵敏度、88%的阳性预测率和100%的阴性预测率，展现了极高的临床相关性[2]。

表1.药筛模型对比

来源：奇迹之光整理

利用肿瘤类器官进行药筛的流程包括类器官的构建、评估、药敏检测三大方面：

构建

类器官的样本来源通常为肿瘤组织或者胸腹水等恶性积液，主流的培养方法包括较为常用的正置胶滴法、适用于肿瘤和睾丸类器官培养的倒置胶滴法、适用于有气体接触的黏膜类器官（肠、呼吸道）培养的气液界面法以及需要较大扩增（脑类器官）的生物反应器法等。以图2的肠道肿瘤类器官的培养流程为例，首先将患者来源的肿瘤样本组织通过机械剪切得到肿瘤细胞团，再将细胞团酶消化成单细胞。分离消化后，将细胞嵌入到基质胶中并在96/384孔板上进行胶滴的种接，再覆盖以培养基和细胞因子培养。类器官培养至直径几百微米的细胞小球即可用于药筛。类器官培养特有的重要试剂包括消化液、培养基（例如Wnt、R-Spondin、Noggin等细胞因子）、基质胶（Matrigel等），这些试剂在不同实验室、公司以及培养不同种类的类器官之间的差异性较大。类器官培养过程中添加生长因子的组合需要进行仔细考量，否则失之毫厘，谬以千里。

图2：肠道肿瘤类器官的培养流程

来源：[3]

评估

在培养好类器官之后，对于类器官的评估和验证也至关重要。通过基因测序、免疫荧光、HE染色等方法，从形态学、组织病理学以及分子遗传学等多个维度对类器官进行鉴定。评估的目的是确定类器官和原肿瘤具有一致性，这也是进行后续药筛的前提。

药敏检测

类器官目前可筛选的药物种类包括化疗药、小分子靶向药、抗体药物等。药筛的核心检测检测指标通常为IC50以及细胞抑制率，根据这些指标在筛查的药物中选取对肿瘤抑制效果**的药物。国内外目前共有超过40项类器官临床相关研究，研究单位和临床注册主体多为医院。如图3所示，在中国的注册临床中，类器官以化疗药的敏感性检测作为主流应用，类器官用于检测靶向药和免疫治疗的敏感性在未来还有极大的发挥空间和应用潜力。

图3. 国内类器官临床注册实验药物类型统计

来源：奇迹之光整理

产业链上游的公司较多，下游开发商业化应用的公司仍处于早期阶段

如下表所示，大部分公司业务范围以提供产业链上游的类器官培养的耗材（包括培养基、细胞生长因子、冻存液、消化液、基质胶等）和设备为主。其中包括老牌的STEMCELL Technologies等细胞试剂提供商和专注于提供类器官试剂的新兴公司（如Prellis Biologics的血管化3D Scaffold、X cell Biosciences的微环境模拟系统等）。中游开展服务类的公司主要提供人或者动物类器官的培养、类器官的冻存建库以及类器官的传代。下游致力于类器官应用的公司通过和药企合作进行新药研发，或者建立患者来源的类器官进行肿瘤药敏筛查，数量并不很多。国外比较有代表性的下游公司包括美国的System 1 Biosciences公司，在2018年末获得了Pfizer Ventures和CRV共同领投的2500万美元的A轮投资，主要开发神经细胞类的类器官用于药物开发。该公司具备自动化的培养验证类器官的技术，可以实现大规模的培养和多模式的检测，结合机器学习赋能药物开发，凸显了自动化在类器官药筛应用中的重要性。从投融资次数和金额来看，类器官整个行业都还处于比较早期的阶段，竞争刚刚起步，还有很多机会。

中国产业化进程并不落后于国外公司

类器官应用于药筛的头部公司需要具备泛癌种培养能力以及达到商业转化水平的稳定性的水平，有严格的质量控制和标准化体系，且在培养涉及的仪器和鉴定筛选平台方面需要往自动化方向靠拢。参考表2可以发现，国外专注类器官业务的公司数量较少，不少公司原来的主营方向为干细胞相关的业务，后续才拓展出了类器官的板块。由于上述壁垒，国内开展肿瘤药筛的类器官公司数量也并不多，但是融资成功的公司（如科途、创芯等）都具备自主研发创新类器官耗材的能力，在类器官培养的各个环节中都掌握着自己特有的know-how，在产业化方面的进展对比国外并没有明显的落后趋势。国内类器官公司的另一发展契机在于目前国内外行业都还没有建立完善的标准，因此中国类器官公司以及研究机构在类器官技术的标准化以及应用指南的建立等方面可以积极参与，未来在行业中可掌握主导优势和话语权。

中国类器官领域科研实力的提升将进一步加速产业化进程

类器官行业在欧洲国家发展较为迅速，这和欧洲类器官科研最早起步以及积累最多必不可分。类器官的领头人Hans Clevers成立的Hubrecht Organoid Technology（HUB）是类器官最早的研发中心，HUB技术授权促进了Epistem、Cellesce、Crown Biosciences、STEMCELL Technologies在内的一批类器官公司的涌现。中国在类器官领域中，近年来其实也呈现出科研数量大幅度上升的趋势，尤其在2019-2020年这两年间显现出了强劲的发展势头，发表的文献数量在全球的排名从第六位（2009-2019年）跃至第二位（2020年），仅次于美国。参考欧洲的类器官发展模式，可以预计中国基础科研积累的提升将加速类器官产业化的进程，在不远的将来我们也将看到更多类器官公司的涌现。

表2.国内外类器官公司

来源：奇迹之光整理

类器官药筛可与二代测序作为组合产品使用，二者在临床上可以有机结合，很好地相辅相成。二代测序从基因层面上检测出患者的靶点突变情况和潜在的药物敏感靶点，为医生和患者提供初步用药选择，但是单凭二代测序结果无法保证完全的临床疗效。部分研究报道和临床案例指出，二代测序筛出的潜在靶向药并没有在实际临床上反应出有效性，这一部分的不确定性通过类器官可以很好排查。例如，Vlachogiannis G课题组分析了一例KRAS野生型CRC患者的治疗过程，针对这类型基因检测结果的患者通常采用抗EGFR的药物进行治疗，然而类器官在抗EFGR的药敏检测中推翻了这一结论，在实际临床情况中也观测到了和类器官筛查结果一致的结果[2]。其次，部分临床医生对于NGS产品的反馈是，基因检测的确能够提供很多数据，但是对于用药指导来说，在测序结果上选出的几个靶向药之间要如何抉择、单靶向药是否足够解决问题、连用的话哪种组合方案更优等问题并不能给出结论性意见，还需要依靠临床医生权衡治疗收益和风险进行主观判断，因此某种程度上反而将问题复杂化了。类器官作为药敏验证的手段，可以在测序基础上进一步锁定有效药物，给出结论性建议以及实际证据。二代测序是根据基因数据从源头寻找结果的过程，而类器官是结果导向的过程：毕竟是骡子是马，拉出来溜溜就知道了。

图4. 类器官结合二代测序进行肿瘤药筛

来源：[8]

1. 类器官培养试剂性能优化和成本下降亟需解决

类器官作为新型的药筛模型，成本虽然较PDX更低，但还是远高于细胞系。类器官成本占比较高的包括培养使用的基质胶，常用的基质胶为美国BD Biosciences公司的Matrigel®，在行业内处于较为垄断的地位，价格较高。Matrigel可以产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料，帮助多种类型的细胞达到附着和分化。Matrigel的来源是小鼠肉瘤细胞系，除了成本较高的问题，同时批次间存在一定的变异性。且由于是动物来源，对于有机类的药物的检测有局限性。考虑到小鼠来源的细胞外基质对于药物筛选实验结果存在一定的干扰，因此基质的工程技术开发用于合成外源差异较小的、非动物来源的基质胶用于成本下降和性能优化将是类器官产业化需要解决的关键性问题之一。基质胶以外，培养也涉及多种细胞因子组合使用，细胞生长因子通常也价格不菲。选择效果更好的细胞因子以及尝试减少使用细胞因子的数量也可以带来成本下降的空间。

2. 类器官完全模拟体内真实器官还需要解决的血管化、免疫化、系统化等问题，考虑到临床实际应用目前很难兼顾

血管化：目前大多类器官本身并不具备血管化的结构。因此，随着类器官体积的增长，类器官受限于氧气的缺失以及代谢废物的增加，可能导致的组织坏死。已有研究构建血管内皮细胞微环境的肿瘤类器官，将类器官肿瘤细胞和血管内皮细胞在Matrigel上共同培养，生成血管结构以期解决类器官血管化缺失的问题。

免疫化：血管化以外的难点还包括模拟肿瘤和免疫环境的相互作用关系。2019年Nature Protocol发表了肿瘤类器官和免疫细胞共同培养的相关protocol，可以体现和模拟出肿瘤微环境的部分特征[5]。以上皮类器官和免疫细胞共培养模型为例，可通过在培养基中添加活化的免疫细胞、在组织消化成单细胞后和免疫细胞共同生长、添加ECM中的重组细胞因子等方法重塑类器官和免疫细胞的相互作用。

系统化：相比于单个类器官，类器官系统的构建能够对药物疗效和潜在毒性做出更完整全面的评估。目前类器官仅能检测出药物对于肿瘤的抑制效果，对于其他器官组织是否存在其他副作用和安全性风险并不能做出预判。为了解决这一问题，2017年Skardal et al.构建了有心脏、肺部、肝脏组成的集成于闭合循环关注体中的类器官系统，以达到全面揭示药物对不同器官的毒性和药效的目的[6]。

尽管以上痛点在类器官的肿瘤研究中有待突破，但从临床应用的角度分析，类器官完美地模拟出原肿瘤的全部功能较为困难。肿瘤组织在人体中是高度异质性的复杂存在，但是对于预测药敏的关键指标来说（如细胞抑制率），类器官只需要达到一定程度的复杂性即可给出较好的答案。以血管化来说，类器官在培养至2个月左右由于缺乏营养供给，会和体内器官形成较大差异，但是对于药筛来说只要类器官在合适的环境中生长至细胞小球即可用于药筛。又比如说，如果某个药物的研究重点是需要跨越血脑屏障，那么相应的脑部类器官构建重点便是需要有完整的血脑屏障结构，对于其他特征（如细胞和周围血管的相互作用）可能并不会优先考虑。血管化、免疫共培养以及系统化的实现可以进一步提高类器官临床预测的准确性，但考虑到周期、成本等关键应用因素，尚且无法兼顾所有条件。有朝一日，如果这些特征都能在成本周期可控的情况下实现，类器官药筛将能够提供更加准确的答案。

3.   类器官药筛的标准化

取样的标准化决定后续类器官培养的成败

标准化的**步即类器官取样就面临着不少的挑战。肿瘤组织取样的部分非常关键，初始的样本量以及细胞质量直接决定了后续培养出的类器官的成功率。样本需要是具有较高活性和干性的细胞，对于肿瘤组织来说，**是来源于干性层的细胞。外层的细胞处于分化的终末期，干性较差；而位于内层的细胞常常处于缺氧坏死的状态，活性较差。以恶性程度极高的胰腺癌为例，只有小于20%的患者能够通过根治性手术切除获得肿瘤切除样本。余下高达80%的患者发现即为中晚期，无法通过手术获得足量的组织样本，类器官的样本来源常常通过超声内镜引导下的细针穿刺活检（EUS-FNA）获取。EUS-FNA穿刺获得的样本量较手术中穿刺的更少，同时还与临床操作医生的经验息息相关。如果穿刺得到的样本量很少、活细胞数量较少、或者没有穿刺到阳性的细胞群，类器官的构建都会面临着较大挑战。对于在肿瘤的什么病灶取什么样本、样本需要满足什么样的条件等需要建立严格的标准以保证后续类器官培养的成功。

自动化需要贯穿类器官培养、鉴定等多个环节以保证标准化

类器官从取样到药筛的每一个步骤都需要严格的把控，对于标准化有很高的要求，可以推测未来类器官培养环节也将提高自动化程度，尽可能提高类器官的可重复性。在类器官的药敏检测流程中已经介绍了类器官需要在凝胶状Matrigel中嵌入生长，物理参数和生长因子可及性的局部差异可能带来类器官在形状、大小和分布等方面的差异性，而临床上药筛类器官的应用需要达到较高的均一性。Lutolf et al.发表了关于类器官培养的自动化技术，采用了非固态的基质，构建了微型工程的水凝胶细胞培养装置。对比传统的Matrigel，非固体的基质使得类器官的均一性和可重复性得到提高，同时也为下游的分析提供了便利性[7]。另外，在类器官鉴定中，采取人工智能的判读对类器官活性、大小等主要参数进行评估，可以同时保证有效性和时效性，进一步缩短整个类器官药筛流程的周期。类器官只有在建立完善的技术标准体系后，类器官的相关研究才能被进一步推动，类器官产业化才得以发展。

古有神农尝百草，今有类器官作为患者替身试百药。作为一种新型的药物筛选和药敏检测模型，类器官应用在近两年来初露锋芒。类器官技术自2009年来历经了多代技术优化和多方向的应用拓展，已经可以在2周的时间内进行较高通量的肿瘤药物筛选，为患者提供准确可靠的用药指导建议，在时效性、可筛药物通量、临床相关性等参数方面明显优于其他药物模型。目前类器官技术在临床产业化应用尚且处于小荷才露尖尖角的状态，国内外真正具备培养和鉴定类器官以及开发类器官药筛的公司数量并不多，产业化的推进还需要解决成本、标准化等限制性因素。随着行业规范的完善和更多临床数据的积累，类器官药筛应用在临床上的广泛开展未来可期。

资料来源：

[1] Li, Mo, and Juan C. Izpisua Belmonte. “Organoids — Preclinical Models of Human Disease.” New England Journal of Medicine, vol. 380, no. 6, 2019, pp. 569–579., doi:10.1056/nejmra1806175.

[2] Vlachogiannis, Georgios, et al. “Patient-Derived Organoids Model Treatment Response of Metastatic Gastrointestinal Cancers.” Science, vol. 359, no. 6378, 2018, pp. 920–926., doi:10.1126/science.aao2774.

[3] Nguyen, Romario, et al. “Application of Organoids in Translational Research of Human Diseases with a Particular Focus on Gastrointestinal Cancers.” Biochimica Et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer, vol. 1873, no. 2, 2020, p. 188350., doi:10.1016/j.bbcan.2020.188350.

[4] Ye, Shicheng, et al. “A Chemically Defined Hydrogel for Human Liver Organoid Culture.” Advanced Functional Materials, vol. 30, no. 48, 2020, p. 2000893., doi:10.1002/adfm.202000893.

[5] Nature Protocol：Tumor organoid-T-cell coculture systems

[6] Skardal, Aleksander, et al. “Multi-Tissue Interactions in an Integrated Three-Tissue Organ-on-a-Chip Platform.” Scientific Reports, vol. 7, no. 1, 2017, doi:10.1038/s41598-017-08879-x.

[7] Brandenberg, Nathalie, et al. “High-Throughput Automated Organoid Culture via Stem-Cell Aggregation in Microcavity Arrays.” Nature Biomedical Engineering, vol. 4, no. 9, 2020, pp. 863–874., doi:10.1038/s41551-020-0565-2.

[8] Es, Hamidreza Aboulkheyr, et al. “Personalized Cancer Medicine: An Organoid Approach.” Trends in Biotechnology, vol. 36, no. 4, 2018, pp. 358–371., doi:10.1016/j.tibtech.2017.12.005.