卢煜明团队新研究！SMRT揭示孕妇血浆存在胎儿长片段cfDNA

图源：PNAS官网

南方医学网讯：12月14日，卢煜明团队在PNAS上发表了题为“Single-molecule sequencing reveals a large population of long cell-free DNA molecules in maternal plasma”的文章¹，似乎为解答这个问题提供了新思路。

研究团队通过单分子实时测序（SMRT，第三代测序技术的一种）在母体血浆中发现了大量长cfDNA分子，并观察到最长的cfDNA分子达到了23，635 bp。这表明，单分子实时测序能克服短测序技术的检测限制，比短cfDNA分子更广泛有效地解码嵌入其中的遗传信息和表观遗传信息。

图源论文：研究设计概述

研究发现，血浆中的长cfDNA分子显示A或G 5′片段末端占优势。此外，有无先兆子痫孕妇的cfDNA分子表现出不同的末端基序谱。例如，先兆子痫母体中的长cfDNA分子减少，末端基序主要以T或C结尾；而无先兆子痫的主要以5′末端的G或A结尾。

由此，检测分析长cfDNA分子或为区分有无先兆子痫孕妇的诊断新途径。

该研究还利用不同测序平台分析母体血浆DNA分子的大小分布。使用SMRT测序分析妊娠晚期孕妇的血浆DNA样本，绘制了320万个的环形一致性测序（CCS，circular consensus sequences）模式，结果显示大于200 bp、500 bp、1 kb和3 kb的cfDNA分子分别占53.7%、35.8%、22.0%和3.8%。（如下图）

图源论文：不同测序平台的母体血浆DNA分子大小分布

由图可见，与Illumina HiSeq(短读长测序)相比，PacBio SMRT测序检测到的长cfDNA比例高出1000倍。

一般来说，与短cfDNA分子相比，长cfDNA分子含有更多的CpG位点。此前，研究团队基于SMRT已开发了被称为“整体动力学（HK）模型”（HK模型）的新方法2，可确定血浆DNA分子上每个CpG位点的甲基化状态，并进行分析，确定其组织来源。

该方法实现了5-甲基胞嘧啶（5mC）的全基因组检测，无需任何化学或酶转化，也不需要在测序前进行PCR扩增，可直接应用于天然DNA，或为肿瘤分析等分子诊断应用开辟更多新的可能。

图源论文：长cfDNA分子的组织来源分析

通过SMRT测序对从7名孕早期孕妇（胎龄：12 6/7至13 6/7周）、妊娠中期10名孕妇（胎龄：17至22 5/7周）和11名妊娠晚期（胎龄：38至38 3/7周）的血浆样本中提取的cfDNA分子进行测序，发现共计800万、1810万和1620万个cfDNA分子。其中，500 bp以上的cfDNA比例分别为：孕早期15.5%、孕中期19.8%、孕晚期32.3%。显然，孕晚期母体血浆样本的cfDNA分子比例更高。

图源论文：不同孕期cfDNA分子的大小分布

卢煜明团队表示，目前的研究工作证明了大量以前未被探索的长cfDNA分子的存在，将为克服这些技术挑战创造动力，为单基因疾病的无创产前检测及潜在临床应用开辟探索途径。

同时，该研究也存在局限：研究样本数量有限，如对血液样本cfDNA分子进行测序的孕妇样本数为28例；病例中缺少父系单倍型信息，而是通过定量分析两种母体单倍型之间的不平衡情况，确定胎儿的母系遗传；组织来源的分析准确性没有达到100%，但可能通过基于电泳、磁珠法或富集长DNA分子等技术加以改进；目前PacBio SMRT测序通量相对较低，使其临床实施面临着成本的挑战。

这篇研究再次将大家的注意力聚焦于NIPT。而被称为“NIPT奠基人”的卢煜明教授也并未满足于已有成绩，不断尝试，探索着NIPT以及液体活检的想象空间，那里似乎还没有天花板。

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参考资料

1、https://www.pnas.org/content/118/50/e2114937118.long

2、https://www.pnas.org/content/118/5/e2019768118?ijkey=d6bfdc49d284989ab4742295b14575e3d6f14e73&keytype2=tf_ipsecsha